技術背景

隨著基因組學技術的飛速發展，轉錄組學作為連接基因組與蛋白組的關鍵橋梁，在孟德爾疾病的臨床診斷中發揮著日益重要的作用。轉錄組是指某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合，而轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）就是用高通量測序技術對轉錄組進行測序分析，反映樣本中信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）及非編碼RNA（ncRNA）的表達情況。其中針對mRNA的RNA-seq是最·常用的轉錄組學技術之一，也是在轉錄組水平上分析差異基因表達、mRNA可變剪切和等位基因失衡等問題不·可缺少的工具。

盡管在孟德爾遺傳病的輔助診斷中，全外顯子組測序（WES）和全基因組測序（WGS）已廣泛應用，但仍存在20%–50%的病例無法明確診斷。而RNA-seq能夠通過發現深度內含子突變、剪接異常、表達量變化等DNA層面難以捕捉的信息，提高2%~7.5%的遺傳診斷率，對基于DNA的NGS方法（WES、WGS）提供的信息進行補充和擴展。

技術流程

1. Total RNA抽提

高質量的 RNA 是整個實驗成功的基礎，因此需要先對抽提總RNA進行質檢，大致內容包括：RNA是否有污染及其降解程度、RNA的純度（OD260/280）、RNA的濃度、RNA的完整性等。

2. 文庫構建

得到質檢合格的RNA后，進行測序文庫的構建。首先需要通過磁珠吸附或其它手段富集mRNA；將富集到的mRNA打斷至二代測序要求的長度并反轉錄成cDNA；之后經過末端修復、3’加A尾、連接接頭、PCR富集等過程完成測序文庫的構建。

3. 上機測序

構建的文庫質檢合格后，通過橋式PCR和可逆終止物測序（illumina平臺）獲得下機原始數據。

4. 數據分析

對下機數據進行過濾，篩選出高質量的數據，通過組間比較（需要設置對照組樣本）著重分析患者樣本中的差異表達基因和差異可變剪切。

技術優勢

目前NGS應用孟德爾遺傳病的輔助診斷中主要是基于DNA層面的檢測（WES、WGS），導致許多類型的突變（如：結構變異、位于基因組非編碼和調控區域的致病突變、可變剪切、同義突變等）存在漏檢的情況，并且單從DNA層面很難對那些意義未明（VUS）的突變，以及一些誤判為“良性"的突變進行解釋。而RNA-seq有助于上述罕見突變的檢出，并從RNA層面補充和擴展基于 DNA 的 NGS 方法提供的輔助診斷信息。

文獻支持

一項研究通過83名WES和WGS未明確診斷的疑似患有孟德爾遺傳病患者進行RNA-seq檢測，確診了14名患者（17%）。這表明RNA-seq可以對WES、WGS等檢測方法進行補充，提高疾病檢出率，并克服基于DNA層面的基因檢測工具的部分局限性。

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